IGF-1 LR3 lyophilisé,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95 %). Cependant, une utilisation à long terme-peut entraîner une désensibilisation des récepteurs et nécessiter une administration intermittente. Des doses élevées peuvent provoquer une hypoglycémie et la glycémie doit être surveillée.
Nous fournissons non seulement de la poudre pure et des capsules, mais également d'autres formes posologiques. Si nécessaire, veuillez contacter notre équipe commerciale.
Nos produits de
IGF-1 LR3 COA
Clonage de gènes et construction de vecteurs d'expression
La conception génétique deIGF-1 LR3 lyophiliséest basé sur la séquence de l'IGF-1 naturel, mais avec les modifications clés suivantes :
Extension N-terminale : ajoutez 13 acides aminés (MFPAMPLSSLFFN) à l'extrémité N-terminale de l'IGF-1 pour prolonger sa demi-vie et améliorer son activité biologique.
Substitution d'acides aminés : remplacez l'acide glutamique (Glu) en position 3 de l'IGF-1 par de l'arginine (Arg), c'est-à-dire une modification R3, pour réduire la capacité de liaison avec l'IGFBP et augmenter la concentration libre.
synthèse de gènes
Obtenez le fragment de gène cible par synthèse chimique ou amplification PCR basée sur la séquence du gène IGF-1 LR3 conçue. La synthèse chimique adopte généralement la technologie de synthèse en phase solide, en ajoutant progressivement des nucléotides et en synthétisant enfin des fragments de gènes complets. L'amplification PCR utilise des séquences IGF-1 connues pour concevoir des amorces et amplifier le gène cible par réaction PCR.
Le choix du vecteur d’expression approprié est une étape cruciale dans l’expression des protéines. Les vecteurs d'expression couramment utilisés comprennent la série pET (telle que pET30a), la série pGEX, etc. Ces vecteurs ont des promoteurs efficaces, de multiples sites de clonage et des séquences d'étiquettes (telles que les balises His), qui facilitent la purification et la détection ultérieures des protéines.
Par exemple, les étapes de construction du vecteur d'expression pET30a sont les suivantes :
Clivage enzymatique : utilisez des endonucléases de restriction telles que BamHI et XhoI pour effectuer un double clivage enzymatique sur le vecteur pET32a et le fragment du gène IGF-1 LR3, produisant des extrémités collantes complémentaires.
Connexion : Le vecteur digéré par l'enzyme et le fragment de gène sont connectés par l'ADN ligase T4 pour former le vecteur d'expression recombinant pET32a-LR3-IGF1.
Transformation : Transformez le vecteur d'expression recombinant en cellules E. coli compétentes (telles que DH5) et obtenez des clones positifs par dépistage d'antibiotiques (telles que l'ampicilline).
Identification : Confirmez l'exactitude du vecteur d'expression recombinant grâce à des méthodes telles que la PCR sur colonie, l'identification par digestion enzymatique ou le séquençage.
Expression des protéines
Sélection de souches d'expression
Le choix de la souche d’expression appropriée est crucial pour l’expression des protéines. Les souches d'expression couramment utilisées incluent Rosetta (DE3), BL21 (DE3), etc. Ces souches possèdent des systèmes d'ARN polymérase T7 efficaces et peuvent exprimer efficacement les gènes pilotés par le promoteur T7.
En prenant Rosetta (DE3) comme exemple, ses caractéristiques incluent : contenir le gène de l'ARN polymérase T7, induit par l'expression de l'IPTG. Le port de gènes d'ARNt de codons rares peut exprimer efficacement des gènes exogènes contenant des codons rares. Convient pour l'expression de protéines toxiques ou difficiles à exprimer.
Optimisation des conditions d'expression
Les conditions d’expression des protéines, telles que la concentration en inducteur, la température d’induction, le temps d’induction, etc., ont un impact significatif sur le rendement et la qualité des protéines. En optimisant les conditions d'expression, le niveau d'expression de l'IGF-1 LR3 peut être augmenté.
Concentration de l'agent inducteur : l'IPTG est un agent inducteur couramment utilisé, avec une concentration généralement comprise entre 0,1 et 1 mM. Déterminez la concentration optimale d’IPTG grâce à des expériences de gradient pour atteindre le niveau d’expression protéique le plus élevé.
Température d'induction : La température d'induction est généralement sélectionnée entre 16 et 37 degrés. Des températures plus basses (telles que 16-20 degrés) peuvent aider à réduire la dégradation des protéines et la formation de corps d'inclusion, et à augmenter le rendement en protéines solubles.
Temps d'induction : Le temps d'induction est généralement compris entre 2 et 24 heures et le temps d'induction optimal est déterminé en analysant les niveaux d'expression des protéines au moyen d'un échantillonnage chronométré.
Détection de l'expression des protéines
L'expression deIGF-1 LR3 lyophiliséa été détecté par les méthodes SDS-PAGE et Western blot.
SDS-PAGE : collectez des échantillons bactériens avant et après l'induction, effectuez une fragmentation par ultrasons ou une lyse chimique, centrifugez pour séparer le surnageant et le précipité, et effectuez une analyse SDS-PAGE séparément. En comparant les modifications des bandes protéiques dans le surnageant et le précipité avant et après l'induction, l'expression de l'IGF-1 LR3 a été confirmée.
Western blot : utilisez des anticorps spécifiques (tels que des anticorps anti-étiquette His ou des anticorps anti-IGF-1) pour effectuer une analyse par immunoblot sur des protéines séparées par SDS-PAGE afin de confirmer davantage l'expression et le poids moléculaire de l'IGF-1 LR3.
Purification des protéines
Lyse bactérienne
Recueillez les cellules bactériennes induites et lysez-les pour libérer des protéines intracellulaires. Les méthodes de craquage courantes incluent la fragmentation par ultrasons, l'homogénéisation à haute-pression, le craquage chimique, etc. En prenant la fragmentation par ultrasons comme exemple, les étapes sont les suivantes :
Collecte bactérienne : centrifugez la solution bactérienne d’expression induite pour collecter les cellules bactériennes et remettez-les en suspension dans un tampon de lyse (tel que du tampon PBS ou Tris HCl).
Fragmentation par ultrasons : la suspension bactérienne est placée dans un bain de glace et broyée à l'aide d'un perturbateur à ultrasons, généralement en utilisant une méthode de fragmentation multiple à court -(telle que 10 secondes à chaque fois, 10 secondes d'intervalle, répétée 10 fois) pour éviter la dénaturation des protéines due à une surchauffe.
Séparation centrifuge : Centrifuger la suspension bactérienne broyée pour séparer le surnageant et le précipité. Le surnageant contient des protéines solubles, tandis que le précipité peut contenir des corps d'inclusion ou des débris cellulaires.
Chromatographie d'affinité
Étant donné que l'IGF-1 LR3 recombinant porte généralement une étiquette His, il peut être purifié par chromatographie d'affinité aux ions nickel (Ni NTA).
Préparation de la colonne : Chargez le garnissage Ni NTA dans la colonne de chromatographie et équilibrez-le avec un tampon d'équilibrage (tel que du PBS contenant 20 mM d'imidazole).
Chargement de l'échantillon : chargez le surnageant du lysat bactérien sur la colonne de chromatographie, permettant à l'IGF-1 LR3 avec son étiquette de se lier aux ions nickel.
Lavage : laver la colonne de chromatographie avec un tampon de lavage (tel que du PBS contenant 50 mM d'imidazole) pour éliminer les protéines d'impuretés non liées ou faiblement liées.
Élution : utiliser un tampon d'élution (tel que du PBS contenant 250 mM d'imidazole) pour éluer l'IGF-1 LR3 lié à la colonne de chromatographie et collecter l'éluant.
Dessalement et concentration
La solution IGF-1 LR3 après élution contient une concentration élevée d'imidazole, qui doit être éliminée par des étapes de dessalement et de concentration pour augmenter la concentration en protéines.
Dessalement : utilisez une colonne de dessalement ou un sac de dialyse pour éliminer l'imidazole de l'éluant et remplacez-le par une solution tampon appropriée (telle que du PBS).
Concentration : Concentrer la solution protéique dessalée à l'aide de tubes d'ultrafiltration ou de concentrateurs centrifuges pour augmenter la concentration en protéines jusqu'au niveau souhaité.
Tests de pureté et d'activité
La pureté et l'activité de l'IGF-1 LR3 purifié ont été détectées par les méthodes SDS-PAGE, HPLC ou ELISA.
SDS-PAGE : analysez la pureté de la protéine purifiée et confirmez qu'il n'y a pas de bandes d'impuretés évidentes.
HPLC : utilisez la HPLC en phase inverse ou la HPLC d’exclusion de taille pour analyser plus en détail la distribution de la pureté et du poids moléculaire des protéines.
ELISA : Le test immuno-enzymatique (ELISA) est utilisé pour détecter l'activité biologique de l'IGF-1 LR3, et son niveau d'activité se reflète dans le degré de liaison à des anticorps spécifiques.
Processus de lyophilisation
Principe de lyophilisation
La lyophilisation est une technique de séchage qui élimine l'humidité par congélation à basse température et sublimation sous vide. Le processus de lyophilisation-comprend trois étapes : la pré-congélation, le séchage par sublimation et le séchage par désorption, qui peuvent maximiser l'activité et la stabilité de la protéine.
Étapes de lyophilisation
Divisez la solution purifiée d'IGF-1 LR3 dans des flacons de lyophilisation ou des flacons de pénicilline et placez-les dans un lyophilisateur pour les pré-congeler en dessous de -40 degrés afin de congeler complètement la solution.
Augmentez progressivement la température jusqu'à environ -20 degrés sous vide, permettant à la glace de se sublimer directement en vapeur d'eau et d'éliminer la majeure partie de l'humidité. À ce stade, il est nécessaire de contrôler la vitesse de chauffage et le degré de vide pour éviter la dénaturation ou l’effondrement des protéines.
Augmentez encore la température à 20-30 degrés pour éliminer l'humidité résiduelle et réduire la teneur en humidité du produit lyophilisé à moins de 1 %. A ce stade, il est nécessaire de maintenir un degré de vide élevé pour assurer une élimination complète de l'humidité.
Une fois le séchage terminé, fermez rapidement le flacon de lyophilisation-ou le flacon de pénicilline pour empêcher l'humidité de pénétrer à nouveau.
Protecteur de lyophilisation
Pour protéger l'activité et la stabilité de l'IGF-1 LR3 pendant la lyophilisation-, il est généralement nécessaire d'ajouter des protecteurs de lyophilisation-. Les protecteurs courants de lyophilisation comprennent :
- Les glucides : tels que l'alginate, le saccharose, le glucose, etc., peuvent former des structures vitreuses et stabiliser la conformation des protéines.
- Les polymères tels que le polyéthylène glycol (PEG) et la polyvinylpyrrolidone (PVP) peuvent augmenter la viscosité des solutions et réduire l'agrégation des protéines.
- Les acides aminés, tels que la glycine et l'alanine, peuvent agir comme donneurs ou accepteurs de liaisons hydrogène, stabilisant ainsi la structure des protéines.
- Les tensioactifs tels que le Tween 20, le Tween 80, etc. peuvent réduire l'adsorption des protéines sur les parois du récipient et améliorer les taux de récupération.
En prenant le tréhalose comme exemple, sa quantité ajoutée est généralement 1-10 fois la masse protéique, ce qui peut former une couche protectrice pendant la lyophilisation pour empêcher la dénaturation des protéines.
Optimisation du processus de lyophilisation
L'optimisation du processus de lyophilisation-est cruciale pour améliorer la qualité desIGF-1 LR3 lyophilisé. En ajustant des paramètres tels que la température de pré-congélation, la température de séchage par sublimation, la température de séchage analytique et le degré de vide, le meilleur effet de lyophilisation-peut être obtenu.
Température de pré-congélation
La température de pré-congélation doit être inférieure au point eutectique de la protéine pour garantir une congélation complète de la solution. Habituellement, des températures inférieures à -40 degrés sont choisies.
Température de séchage par sublimation
La température de séchage par sublimation doit être inférieure à la température d'effondrement de la protéine pour éviter la dénaturation de la protéine ou l'effondrement du récipient. Habituellement, environ -20 degrés sont choisis.
Température de séchage d'analyse
La température de séchage d’analyse doit être supérieure à la température de séchage par sublimation pour éliminer l’humidité résiduelle. Habituellement, 20 à 30 degrés sont choisis.
Degré de vide
Le degré de vide doit être maintenu à un niveau bas (tel que<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
étiquette à chaud: igf-1 lr3 lyophilisé, Chine igf-1 lr3 fabricants lyophilisés, fournisseurs, CJC 1295 Tablets, Injection d'IGF 1 LR3, IGF 1 LR3 lyophilisé, Pilule d'ipamoréline, Poudre PT 141, Injection de peptide tésamoréline
